Antigen - reakce protilátek
Specifická interakce protilátek s odpovídajícími antigeny, v důsledku čehož se tvoří komplexy antigen-protilátka (imunitní komplexy). Konečným výsledkem této reakce je často vazba toxinů, imobilizace virulentních bakterií a neutralizace virů. Místa vázající antigen molekuly protilátky mohou vázat několik nepříbuzných antigenů. Tyto antigeny jsou strukturně podobné a nazývají se křížově reagující antigeny. Homogenní populace molekul protilátky může vázat různé molekuly s velmi malou nebo žádnou strukturální podobností. V tomto případě se mluví o multispecifické vazbě, což je vysvětleno tvorbou vazeb na různých místech uvnitř center vázajících antigen..
Reakce antigen-protilátka probíhá ve dvou fázích, které se liší mechanismem a rychlostí. První fáze je specifické spojení aktivního centra protilátky s odpovídajícími skupinami antigenu nebo haptenu (viz Antigeny); druhá, nespecifická fáze následující po první, je vizuálně pozorovanou reakcí. Když protilátky interagují s jednoduchými hapteny, druhá fáze obvykle chybí. Za určitých podmínek, například v nepřítomnosti solí, může nastat první fáze, ale druhá nemůže. První fáze je vždy rychlá a druhá je někdy velmi pomalá.
Vazba antigen-protilátka je reverzibilní; síla vazby, nazývaná afinita, může být kvantifikována stanovením asociační konstanty. Existuje také termín avidita protilátky, který se používá k popisu celkové síly interakce multivalentní protilátky s polydeterminantním antigenem.
Ve většině případů jsou protilátkové populace objevující se v séru imunizovaných zvířat heterogenní sadou molekul s různými místy vázajícími antigen a různými afinitami k antigenu. Heterogenita populace protilátek, pokud jde o afinitu a specificitu, odráží heterogenitu buněk vylučujících protilátku. Každá buňka produkující protilátku produkuje homogenní populaci molekul. Často se poznamenává, že ke zvýšení průměrné afinity protilátek dochází s rostoucí dobou po imunizaci. Tato "maturace imunitní odpovědi" odráží výběr buněk, které tvoří více afinitních protilátek, a umožňuje velmi malému počtu protilátek, aby účinněji reagovaly s antigenem a vytvářely obranyschopnost těla, když do něj mikroorganismy znovu vstoupí..
Při studiu mechanismu interakce protilátek s antigenem pomocí spektrofolarimetrie a dalších fyzikálně-chemických metod bylo zjištěno, že v okamžiku vazby hapten na protilátku dochází ke konformačnímu přeskupení molekuly protilátky. V tomto případě se molekula protilátky stává odolnější vůči působení různých denaturačních činidel, jakož i vůči hydrolýze proteolytickými enzymy. Je zřejmé, že v procesu vazby determinantní skupiny antigenu dochází k adaptivnímu přeskupení aktivního centra protilátky..
Interakce protilátky s molekulou antigenu je zase doprovázena změnami v prostorové struktuře antigenu. Metmyoglobin je tedy přeměněn na apomyoglobin v důsledku komplexace s protilátkou zaměřenou na apomyoglobin a p-galaktosidáza postrádající aktivitu je přeměněna na aktivní enzym v důsledku reakce s protilátkami na aktivní formu p-galaktosidázy. Když tedy antigen interaguje s protilátkou, obě sloučeniny mají vzájemný účinek na jejich vlastní prostorovou konformaci. Výsledné konformační změny jsou reverzibilní. Protilátky extrahované z imunitních komplexů si zachovávají aktivitu vázající antigen a neliší se v chemických a fyzikálních vlastnostech od nativních protilátek.
Povaha reakcí probíhajících ve druhé fázi A. - a. p., je do značné míry určována fyzikálními vlastnostmi antigenu a projevuje se ve formě několika základních jevů (aglutinace, neutralizace toxinů a srážení).
Fenomén aglutinace spočívá v tom, že se mikroorganismy, živočišné buňky nebo jiné korpuskulární antigenní částice v suspenzi, pod vlivem protilátek, drží pohromadě. Aglutinační reakce našla široké uplatnění pro stanovení lidských krevních skupin, Rh faktoru, kvantitativní stanovení protilátek a antigenů.
Reakce neutralizace toxinů je založena na vlastnostech antitoxinů (protilátek proti toxinům), které je v kombinaci s odpovídajícími toxickými látkami neutralizují. Stupeň neutralizace může být vysvětlen podáváním směsi toxin-antitoxin citlivému zvířeti. Množství antitoxinu v imunitním séru je charakterizováno množstvím minimálních letálních dávek toxinu, které lze neutralizovat určitým množstvím séra. Neutralizační reakce se používá ke stanovení koncentrace toxinů původců záškrtu, tetanu atd. K tomu se používají standardizovaná antitoxická séra..
Fenomén srážení spočívá ve tvorbě nerozpustných komplexů antigen-protilátka v důsledku kombinace rozpustného antigenu se specifickými protilátkami a srážení tohoto komplexu. Zvláštním případem srážkové reakce je imunitní flokulační reakce, která se vyskytuje pouze v relativně úzkém rozmezí koncentrací antigenu a při mírném přebytku protilátek a antigenu se tvoří rozpustné komplexy. Srážková reakce se používá pro kvantitativní stanovení antigenů a protilátek, koncentrace imunoglobulinů různých tříd v krvi lidí, při soudním lékařském vyšetření k určení druhu proteinů krevního séra v reakci Chistovich - Ulengut.
Schopnost protilátek kombinovat antigenní částice do velkých konglomerátů (aglutinace bakteriálních a jiných buněk, srážení rozpuštěných antigenů) je způsobena přítomností alespoň dvou aktivních center v molekule protilátky. Jedna specifická skupina se váže na jeden antigenní determinant, druhý - na podobný determinant jiné antigenní částice. Bivalence protilátek umožňuje kombinovat neomezený počet antigenních částic do konglomerátů. S různým počtem antigenních determinant na molekule antigenu může být povaha struktury konglomerátů komplexu antigen-protilátka odlišná. Při nadbytku antigenu nebo protilátek se velké konglomeráty vůbec neobjevují kvůli naplnění reakčních oblastí molekul nadbytkem druhé složky. V důsledku toho A. - a. R. se maximálně projevují pouze v určitém koncentračním rozmezí obou činidel v tzv. zóně ekvivalence.
Interakce antigenu s protilátkou vede k implementaci řady biologických (efektorových) funkcí protilátek. Patří k nim jevy vazby komplementu, lýzy, cytotoxicity závislé na protilátkách a opsonizace.
Fenomén vazby komplementu je přidání komplementu do komplexu antigen-protilátka. Doplněk je vícesložkový samoskládací systém krevních bílkovin, který hraje jednu z klíčových rolí při udržování imunitní homeostázy. Aktivace komplementového systému indukovaná jako výsledek A. - a. R., je doprovázen četným porušením homeostázy spojené především s poškozením buněk nebo změnami jejich funkce. Pouze dvě třídy protilátek (lgG a lgM) poskytují aktivaci komplementového systému. V závislosti na specificitě protilátek, typu cílových buněk, počtu a povaze složek komplementu účastnících se reakce, lze pozorovat nevratné poškození buněčné membrány, zvyšuje se citlivost na fagocytózu, uvolňují se farmakologická činidla, jako je histamin, a může dojít k řízené migraci buněk (chemotaxe). Reakce vázání komplementu je založena na schopnosti komplementu navázat se na komplex antigen-protilátka, který se používá při diagnostice syfilis (Wassermanova reakce), radost z virových infekcí, studium protilátek proti tkáni a autoprotilátek.
Fenomén lýzy je schopnost některých protilátek v přítomnosti komplementu rozpustit buňky, proti nimž vznikly. Fenomén buněčné cytotoxicity závislé na protilátkách je kontaktní lýza zabíječskými buňkami (K-buňkami) cizích buněk potažených IgG protilátkami. Tento proces je nezávislý na systému doplňků. Fenomén opsonizace spočívá v tom, že protilátky zvyšují fagocytární aktivitu neutrofilů a makrofágů ve vztahu k antigenům, proti nimž jsou získány.
Bibliografie: Boyd W. Základy imunologie, trans. z angličtiny, M., 1969; Veisman I.L. Hood L.E. a Wood, W.B. Úvod do imunologie, trans. z angličtiny, str. 66, M., 1983; Immunology, ed. W. Paul, trans. z angličtiny, t. 1, M., 1987; Kulberg A.Ya. Molecular Immunology, str. 91, M., 1985; Cabot E. a Meyer M. Experimentální imunochemie, trans. z angličtiny, M., 1968; R.V. Petrov Immunology. 36, M., 1987.
Vše o protilátkách proti erytrocytům
Období těhotenství pro každou nastávající matku je úžasné a vzrušující zároveň. Každá žena, která nosí své drahé dítě pod srdcem, prožívá a přeje si snadné těhotenství a porod. Rh negativní maminky však mohou čelit některým otázkám ohledně Rh negativní krve a zdraví jejich dítěte..
Protilátky proti erytrocytům - co to je?
Rh-pozitivní a Rh-negativní erytrocyty
Protilátky jsou proteinové sloučeniny v krevní plazmě, které jsou produkovány v reakci na přítomnost specifického antigenu. Interakcí protilátka a antigen společně tvoří imunitní komplex, který vyvolává určité reakce v imunitním systému těla. Pokud mluvíme o protilátkách proti erytrocytům, máme na mysli proteinové sloučeniny, které jsou produkovány v reakci na antigeny na povrchu červených krvinek. Role antigenů erytrocytů je nejčastěji faktor Rh, což je v podstatě protein na membráně erytrocytů. Z toho je možné vyvodit jednoduchý a srozumitelný závěr, kdo jsou Rh-negativní a Rh-pozitivní pacienti. Rh-pozitivní pacienti mají protein na povrchu erytrocytů, u Rh-negativních pacientů tento protein chybí.
Když se tvoří protilátky?
Krevní transfuze může způsobit tvorbu protilátek
Pokud se obrátíme na imunologii, je známo, že protilátky se vytvářejí poté, co lymfocyty potkaly cizí antigeny, které vstoupily do těla. Tvorba takových cizích antigenů je možná v následujících případech:
- Krevní transfúze nebo krevní transfúze. Jakmile jsou v těle pacienta, který potřebuje krevní transfuzi (příjemce), imunitní systém rozpoznává červené krvinky dárce jako cizí antigeny (látky). V reakci na ně se začnou vytvářet protilátky proti erytrocytům..
- Těhotenství. Během těhotenství mohou fetální Rh-pozitivní červené krvinky vstoupit do krevního řečiště Rh-negativní matky přes placentu. Její tělo rozeznává tento protein na povrchu dětských erytrocytů jako cizí antigen a produkuje anti-rhesus protilátky v reakci.
Během transfúze krve i během prvního těhotenství je množství syntetizovaných protilátek malé, takže nemohou mít škodlivé účinky na tělo. Imunitní systém má však díky B-lymfocytům jakousi „paměť“. Proto druhé těhotenství nebo jiná krevní transfúze nezůstane bez povšimnutí. V reakci na tyto okolnosti se začíná syntetizovat obrovské množství protilátek, což může vést k nebezpečným změnám v lidském těle. V případě těhotenství to může být její potrat..
Typy protilátek
Mechanismus tvorby imunitních protilátek proti erytrocytům
Existují dva typy protilátek proti erytrocytům - přírodní a imunitní.
- Přirozené (pravidelné) protilátky proti erytrocytům jsou vždy vytvářeny a jsou vrozené a vytvářejí se jako reakce na antigeny anti-erytrocytů ze systému ABO..
- Imunitní (nepravidelné) protilátky, na rozdíl od předchozích, se vytvářejí, když cizí agent vstupuje do těla - výše uvedené případy s těhotenstvím a krevní transfúzí. Další název pro takové proteinové sloučeniny je alloimunní nebo isoimunní. Tyto protilátky nereagují s vlastními, ale s cizími antigeny vstupujícími do lidského těla. Kromě výše uvedeného existuje koncept fixovaných protilátek nebo autoprotilátek. Z posledního slova je zřejmé, že tyto protilátky jsou produkovány proti antigenům svých vlastních erytrocytů pod vlivem určitých faktorů. Podobná situace může být pozorována u hemolytického onemocnění novorozenců, autoimunitní anémie léčiv atd..
Celkově povrch erytrocytů obsahuje asi 100 antigenů, které představují 19 samostatných systémů. Rh faktor je nejvíce imunogenní. To znamená, že v reakci na to je reakce imunitního systému nejvýraznější..
Protilátkový test
Podstata aglutinační reakce
Test pro stanovení protilátek je založen na aglutinační reakci. Je charakterizována tvorbou vloček nebo sedimentu, který reaguje s protilátkami s antigeny. Pro studii byla odebrána žilní krev. Test na protilátky proti erytrocytům je indikován v následujících případech:
- stanovení kompatibility dárce a příjemce před provedením krevní transfúze;
- identifikace možného Rh-konfliktu u matky a plodu.
Příprava zkoušky není zvláštní a skládá se z následujících jednoduchých doporučení, která jsou snadno dodržitelná. Zde je co hledat:
- Je nutné darovat krev ráno a na lačný žaludek. Takto lze test provést na pozadí omezeného příjmu tekutin. Poslední jídlo by mělo být nejpozději osm hodin před zahájením testu.
- Nedoporučuje se jíst smažená nebo kořenitá jídla den předtím, pít alkohol.
- V předvečer se doporučuje vyloučit jakoukoli fyzickou aktivitu. Před testováním by pacienti měli být v klidu alespoň půl hodiny. To znamená, že musíte přijít o něco dříve než ve stanovený čas a sedět.
- Vyhněte se kouření v posledních 30 minutách před provedením testu.
Provedení a interpretace testu
Dekódování aglutinačního testu
První fáze: erytrocyty a sérum příjemce (pacienta) se zavedou do jedné zkumavky. Pokud jsou přítomny protilátky, jsou fixovány na povrchu červených krvinek.
Druhá fáze: Reagované nebo nezreagované erytrocyty se přenesou na sklo. Přidá se zde také standardní antiglobulinové sérum s protilátkami proti lidskému imunoglobulinu. Pokud jsou protilátky fixovány na erytrocyty, je pozorována pozitivní aglutinační reakce - sediment nebo vločky. Jinak je reakce považována za negativní..
V závislosti na síle aglutinační reakce se rozlišují následující výsledky:
- silný pozitivní nebo 4 plus,
- pozitivní nebo 3 plus,
- slabě pozitivní - 2 klady,
- velmi slabě pozitivní - 1 plus,
- negativní - mínus.
Jsou anti-erytrocytické protilátky normální? Ano, existují, ale ve velmi malém množství, které nelze určit konvenčními metodami. Před interpretací testu je důležité si uvědomit, že test může být pozitivní, pokud žena v posledních 6 měsících dostala injekci anti-Rhesus a imunoglobulinu. Kromě toho lze pozorovat negativní výsledek u dítěte, pokud je reakce pozitivní..
Protilátky proti antigenům
IMUNICKÝ SYSTÉM MAKROORGANISMU
Přednáška číslo 7
Specifické obranné mechanismy / získaná imunita, imunitní reakce / implikují rozpoznávání imunitního systému geneticky cizími látkami / antigeny buňkami a specifická reakce na ně, která se může projevit ve formě několika reakcí:
- tvorba protilátek / imunoglobulinů /
- imunologická tolerance / specifická nezodpovědnost /
- okamžitá přecitlivělost / alergie /
- přecitlivělost / alergie na opožděný typ /
- idiotyp-anti-idiotypická interakce. Tyto reakce a celková imunitní odpověď jsou funkcí imunitního systému..
Imunitní systém je soubor všech lymfoidních orgánů a buněk, které tvoří jeden difuzní orgán imunity. Buňky tohoto orgánu neustále cirkulují s krevním oběhem v celém těle. Hlavní buňkou imunitního systému jsou lymfocyty. Ústředními orgány imunitního systému jsou thymus / thymus / a kostní dřeň. V nich probíhá diferenciace, tj. vývoj a „výcvik“ lymfocytů, které se stávají T-lymfocyty a B-lymfocyty. Periferní orgány imunity - slezina, lymfatické uzliny, lymfatické folikuly / plaky /, monocyty cirkulující v krvi. V těchto orgánech se vytváří specifická imunitní odpověď. Imunitní odpověď se provádí imunokompetentními buňkami / imunocyty /, tj. T-lymfocyty, B-lymfocyty a makrofágy, v rámci spolupráce s účastníky mediátorů / chemických zprostředkovatelů /.
Rozlišujte mezi humorální imunitní odpovědí / tvorbou protilátek, tvorbou alergie okamžitého typu / a buněčnou imunitní odpovědí spojenou s akumulací senzibilizovaných T-lymfocytů / zpožděnou hypersenzitivitou atd. /.
Imunitní odpověď je řízena geny oblasti I 6. páru lidských chromozomů. Spouštěčem jakékoli imunologické reakce je kontakt imunitního systému s antigenem..
Antigeny jsou látky, které nesou znaky genetické cizince a po zavedení do těla způsobují vývoj imunologických reakcí. Pokud látka způsobuje alergii, nazývá se alergen. Podmínky, za nichž může být látka antigenem:
I / cizost / ve vztahu k imunitnímu systému konkrétního organismu /
2 / dostatečně velká molekulová hmotnost / více než 10 kilodaltonů /
3 / spíše složitá struktura
4 / rigidní uspořádání determinantních skupin v molekule
5 / dobrá rozpustnost ve vnitřním prostředí těla.
Antigeny jsou: proteiny různého původu, komplexní polysacharidy, lipopolysacharidy, komplexy proteinů s lipidy nebo nukleovými kyselinami. Nejedná se o antigeny: jednoduché anorganické a organické sloučeniny, lipidy, čisté přípravky nukleových kyselin. Následující vlastnosti jsou charakteristické pro vysoce kvalitní antigeny: cizost, antigenicita, imunogenita a specificita. Cizinec je znamením / "pečetí" / práce cizího genomu / organismu /. Vyskytuje se na vysoké úrovni organizace biomolekul / například chybí v aminokyselinách nebo peptidech, ale vyskytuje se v komplexních proteinech /. "Cizí je relativní / králičí proteinový albumin není cizí králíkovi, ale cizí myší nebo morčatům /. Antigenicita - schopnost vyvolat imunologické reakce větší či menší závažnosti / například globulin má větší antigenicitu než albumin, protože po zavedení globulinu více protilátek se tvoří /. Imunogenita - schopnost vyvolat imunitu / rezistenci vůči mikrobům nebo toxinům /. Například antigeny původce tyfu nebo spalniček jsou více imunogenní než antigeny původce úplavic, po kterých neexistuje trvalá imunita a opakovaná onemocnění. jak se antigeny liší od sebe. Je to určeno jejich chemickou strukturou. Nejvýznamnější chemické skupiny pro specificitu / antigenní determinanty /: mají hydrofilitu, koncentrují určitý náboj a jsou orientovány směrem ven. Počet antigenních determinantů / valencí / připojujících I k protilátkové molekule, v různých ntigeny se pohybují od 10 do 1000 nebo více.
Následující typy antigenů se rozlišují podle specificity:
I / druhový antigen, je určen u všech zástupců tohoto druhu a není přítomen u zástupců jiných druhů / v mikrobech, zvířatech, lidech, může být detekován při reakci s druhově specifickou imunitou
2 / typ antigenu, způsobuje rozdíl mezi jedinci stejného druhu; Například agent Flexnerovy úplavice má 6 antigenních variant - serovary. U lidí se rozlišuje více než 70 isoantigenů, které způsobují rozdíly v krevních skupinách, faktor Rh, antigeny tkáňové kompatibility. Neshoda v isoantigenech dárce a příjemce může být důvodem pro odmítnutí transplantované tkáně nebo orgánu,
3 / heterogenní antigen, je společný zástupcům různých druhů; původce moru a dalších mikrobů má tedy společné antigeny s lidskými tkáněmi / antigenními mimokyiemi; běžné antigeny mohou být zástupci různých typů mikrobů patřících do stejné rodiny, nebo velmi oddělených / skupinových antigenů /,
4 / autoantigeny jsou látky, které mohou imunizovat tento organismus
ze kterých pocházejí. Normální autoantigeny jsou tkáně
organismy, které normálně nepřicházejí do styku s imunitním systémem
/ mozek, oční čočky, varlata /; v případě zranění mohou imunizovat tělo. Patologické autoantigeny mohou být patologicky změněné tkáně po omrzlinách, popáleninách, záření, působení mikrobiálních toxinů.
Všechny antigeny lze rozdělit na plnohodnotné, které mají všechny vlastnosti antigenu, a defektní / hapteny /. Hapteny jsou látky, které po zavedení do těla nejsou schopné vyvolat imunologické reakce, ale vstupují do specifických reakcí s předem připravenými protilátkami nebo imunocyty. Hapteny se stávají plnohodnotnými antigeny po rozšíření molekuly / spojení s proteinem, polysacharidem nebo jiným nosičem /. Hapteny mohou být: jednoduché polypeptidy, lipidy, nukleové kyseliny, jednoduché organické látky, antibiotika, formaldehyd atd. Jednoduché hapteny, když interagují s odpovídajícími protilátkami, nedávají viditelnou srážkovou reakci / srážení / a komplexní hapteny dávají / srážejí /. Při pronikání do těla se hapteny mohou kombinovat s bílkovinami / bez nebo ve složení buněk / a stát se plnohodnotnými antigeny, které imunizují tělo. To může vést k patologickým stavům / kontaktní dermatitidě u pracovníků při výrobě antibiotik nebo vitamínů, alergických reakcích po podání léčiv; pokud má hapten afinitu k krevním buňkám, může se vyvinout anémie, leukopenie nebo purpura /.
Mikrobiální antigeny. Patří sem: celé mikrobiální buňky / usmrcené a živé /, toxiny, produkty rozkladu buněk, extrahované z buněk frakce. V antigenní struktuře mikrobiální buňky existují: H-antigen / proteinový antigen bičíků /, K-antigen / povrchový protein nebo polysacharidový membránový antigen /, O-antigen / lipopolysacharid buněčné stěny, somatický antigen /, cytoplazmatické antigeny. Antigen s nejvyšší antigenicitou a imunogenitou se nazývá ochranný antigen mikrobu, který po podání přispívá k vytvoření stabilní imunity. Proto se do vakcín zavádějí ochranné antigeny. Cíle studia mikrobiálních antigenů:
- stanovení typu a varianty / identifikace / patogenu antigenní strukturou,
- rychlá indikace / detekce / mikrobů ve zkoušeném materiálu imunologickými metodami / použitím imunoglobulinových přípravků
- design antigenních přípravků / diagnostik, alergenů / pro diagnostiku infekčních onemocnění imunitní odpovědí těla / serodiagnostika - detekce protilátek, diagnostika alergií - detekce senzibilizovaných lymfocytů,
- tvorba vakcín a séra pro prevenci a léčbu infekcí.
Přípravy mikrobiálních antigenů lze získat z kultivační tekutiny / sekretované / nebo různými druhy působení na buňky / zahřívání - 0-antigen, ošetření formalinem - H-antigen; používat také ultrazvukové dezintegrace, frakcionaci, chemickou extrakci atd. /. Antigeny mohou být vytvářeny in vitro chemickou syntézou / syntetické antigeny /.
Protilátky jsou proteiny živočišného původu vytvářené lymfoidními orgány obratlovců během zavádění antigenů a jsou s nimi schopny vstoupit do specifických interakcí. Liší se svou speciální strukturou a vlastnostmi, jsou součástí gama-globulinové frakce krevního séra, a proto se nazývají imunoglobuliny..
Vlastnosti protilátek: specificita a řada fyzikálně-chemických vlastností Specifičnost - schopnost reagovat pouze s antigenem, který způsobil jejich tvorbu.
Fyzikálně-chemické vlastnosti; a / relativní tepelná stabilita, b / relativní odolnost vůči působení proteáz, c / odolnost vůči denaturaci ethanolem při 0-4 ° C, g / vysrážená bez denaturace neutrálními solemi / síranem amonným atd. /. Tyto vlastnosti se používají při přípravě imunoglobulinových přípravků.
Existuje 5 tříd imunoglobulinů (Ig), lišících se hmotností / 150 - 900 KD /, fyzikálně-chemickými vlastnostmi, strukturou a funkčními charakteristikami: G, M, A, E, D. Převážná část imunoglobulinů v séru jsou protilátky tří tříd: IgG / 70 -80% /, IgA / 10-15% / a IgM / 5-10% /; zbytek / IgE a IgD / - 0,2%.
Struktura imunogdobulinu / IgG, monomeru /. IgG sestává ze 4 polypeptidových řetězců spojených disulfidovými vazbami: pár identických těžkých / 50 CD / a pár identických lehkých / 23 CD / řetězců s kloubem uprostřed molekuly. Při ošetření proteolytickým enzymem papain se IgG rozpadne na 3 fragmenty: 2 identické s aktivními centry / antideterminantními skupinami / - Fab1 a Fab2, schopné reagovat s antigenem, a fragment Fc / krystalizující, konstantní /, který se na antigen neváže. Volné konce / aktivní centra / obou fragmentů Fab jsou složeny z variabilních oblastí - těžkých a lehkých řetězců. Konfigurace aktivního centra opakuje prostorovou strukturu antigenního determinantu ve formě dutiny (jako rukavice opakuje tvar ruky). Zbývající části molekuly jsou konstantní, tj. mají stejné aminokyselinové sekvence v protilátkách různé specificity. Tato místa / Fc / protilátky mohou být adsorbovány například na speciálních receptorech imunocytů.
IgG jsou bivalentní - mají 2 aktivní místa, IgM jsou pentavalentní - mají 5 aktivních míst / pentamer /.
Stručná charakteristika tříd imunoglobulinů.
IgC - sérové protilátky / 150 KD /, ve velkých množstvích, se vytvářejí při opakovaném příjmu antigenu, procházejí placentou, jsou vysoce specifické, neutralizují mikrobiální částice a toxiny, interagují s hapteny.
IgM - sérové protilátky / 900 KD /, objevující se 1. den po prvním kontaktu s antigenem, jsou méně specifické než IgG, neprocházejí placentou, ale mohou být v sekrecích na sliznicích, aktivně vážou komplement, účastní se lýzy buňky.
IgA - obsažené v krevním séru / monomeru, 170 KD / a ve sekrecích / mléce, na "sliznicích - dimeru, 430 KD /. Při průchodu / z krevního řečiště / přes epitel získávají" sekreční složku ", která chrání molekulu před destrukcí enzymy sekrecí. IgA má velký význam při vytváření lokální imunity, brání přilnutí mikrobů k epiteliálním buňkám a jejich kolonizaci sliznic.
IgE - sérové termolabilní protilátky-reaginy / 190 KD /; mají cytofilitu / jsou fixovány na buňkách /, což přispívá k rozvoji okamžitých alergických reakcí; nepřecházejte placentou; zvýšení vaskulární permeability.
IgD - sérum tepelně labilní protilátky / 180 KD /, jejichž funkce
Rozlišujte mezi úplnými a neúplnými protilátkami. Plné protilátky mají 2 nebo více valencí a tvoří s antigenem komplexní sloučeniny / síťové struktury /. Protože se molekula protilátky I může vázat na 2 nebo více antigenů, vede ke změně fyzikálně-chemického stavu antigenu a viditelných jevů - aglutinace / flokulace / srážení / srážení / atd. Neúplné protilátky / blokující / monovalentní, protože... mám aktivní centrum. Nedávají síťové struktury a nejsou detekovány v přímých reakcích imunity / jsou detekovány nepřímými metodami - neutralizací antigenu nebo Coombsovým antiglobulinovým testem /.
Dynamika akumulace protilátek se liší v závislosti na tom, zda tento antigen vstupuje do těla primárně nebo sekundárně. V primární imunitní odpovědi mohou být protilátky detekovány v krvi 3-4 dny po expozici antigenu. Jedná se o latentní / induktivní / fázi imunogeneze - období latentní antigenní stimulace a kooperativní interakce imunocytů, v důsledku čehož se tvoří plazmatické buňky a akumulují se z B-lymfocytů, čímž vznikají protilátky / produktivní fáze imunogeneze /. Maximální množství protilátek je pozorováno ve dnech 7-20; poté dochází ke snížení titru na minimum, ke kterému dochází za 2-3 měsíce. Od začátku produktivní fáze (vznikají IgM, poté jsou navíc produkovány IgG a IgA, sekundární imunitní odpověď má následující rozdíly: a / zkrácená doba latence, b / rychlejší zvýšení koncentrace protilátky,
c / vyšší hodnoty maximálních titrů / 3 nebo vícekrát /
d / produkované protilátky jsou IgG. Schopnost takové zesílené reakce přetrvává až několik let a je jedním z projevů imunologické paměti, která je v těle udržována senzibilizovanými T-lymfocyty. Tyto vzorce imunogeneze jsou základem moderních metod vakcinace / revakcinace /.
Interakce antigen-protilátka
Laboratorní výzkumné metody a experimentální systémy se používají ve výzkumných a diagnostických laboratořích pouze s určováním protilátek (například sérologické metody), zatímco jiné používají metody molekulární biologie, genetického inženýrství, buněčných kultur a zvířecích modelů, které jsou z velké části přispívají k pochopení fyziologie a patofyziologie imunitního systému.
V roce 2000 byla objevena sekvence lidského genomu. Díky aktivním pokusům o dešifrování sekvence genomů mikroorganismů se objevily slibné přístupy ke studiu imunitního systému - výzkum využívající bioinformatiku a výpočetní biologii (tzv. Experimenty s oxidem křemičitým). Tyto technologie jsou založeny na datech ze studia genomiky a proteinomiky a používají výkonné počítačové programy a výpočetní algoritmy. Jsou velmi nadějní pro imunologii..
To je zvláště důležité při pokusu o identifikaci imunogenních epitopů exprimovaných patogeny, které lze později použít k získání vakcín. I když toto téma nespadá do oblasti působnosti této kapitoly, je důležité si uvědomit, že budoucí pokrok v imunologii vyplyne z kombinace výzkumných technik in vitro, in vivo a oxidu křemičitého..
Interakce antigen - protilátka
Reakce mezi antigenem a protilátkami v séru (sérologie) je základem mnoha studií imunitního systému. Vzhledem k přísné specifičnosti imunitní odpovědi pro diagnostické účely, detekci a identifikaci antigenů nebo protilátek je široce používána interakce mezi antigenem a protilátkou in vitro. Příkladem použití sérologických metod pro identifikaci a klasifikaci antigenů je sérotypizace mikroorganismů pomocí specifického antiséra..
Interakce antigenu s protilátkami může vést k různým důsledkům, včetně srážení (pokud je antigen rozpustný), aglutinace (pokud je antigen pevná částice) a aktivace komplementu. Všechny tyto výsledky jsou způsobeny interakcemi mezi multivalentními antigeny a protilátkami, které mají alespoň dvě místa pro vazbu antigenu. Uvedené reakce, které se vyvinou během interakce antigen-protilátka, nejsou charakteristické pro primární protilátkovou odpověď na odpovídající antigenní epitopy, ale ve větší míře odrážejí události, které se vyvinou během opakované interakce polyvalentních antigenů s protilátkami.
Jevy, jako je srážení, aglutinace a aktivace komplimentu, se vyvíjejí, pokud protilátka se dvěma nebo více vazebnými místy reagovala s haptenem (například antigen s jedním determinantem je monovalentní); jsou však iniciovány interakcí monovalentních fragmentů protilátek (např. Fab) s antigenem, i když je antigen polyvalentní. Důvody těchto rozdílů jsou uvedeny na Obr. 5.1.
Obr. 5.1. Interakce mezi protilátkami nebo protilátkovými fragmenty a antigeny nebo hapteny
Pro srážení, aglutinaci nebo aktivaci komplimentu je nutné, aby protilátky zesíťovaly různé antigenní molekuly, což je možné, pouze pokud je antigen polyvalentní, a protilátka je bivalentní (buď intaktní protilátky nebo F (ab ') 2-fragment sestávající ze dvou míst vázajících antigen) ( viz obrázek 5.1). Naproti tomu není možné zesítění, pokud je antigen nebo protilátka monovalentní.
Primární interakce mezi protilátkou a antigenem
Kovalentní vazby nejsou zapojeny do interakce mezi protilátkou a antigenním epitopem. V důsledku toho jsou síly, které je spojují, relativně slabé. Patří sem hlavně Wonder Waals, elektrostatické a hydrofobní síly; vyžadují velmi blízký přístup mezi vzájemně se ovlivňujícími prvky.
Antigenový epitop a protilátka se tedy musí přesně shodovat pro interakci, která se často porovnává s interakcí klíč-zámek. Vzhledem k tomu, že v interakci mezi antigenem a protilátkou jsou zapojeny slabé síly, komplex antigen-protilátka se může snadno disociovat pod vlivem nízkého nebo vysokého pH, hyperosmolarity roztoku nebo chaotropních iontů (například pianátů), které účinně ničí vodíkové vazby molekul vody.
Konstantní asociace
Je vhodné zvážit interakci mezi protilátkou a antigenním epitopem na příkladu reakce mezi protilátkou a monovalentním haptenem. Protože je molekula protilátky symetrická a má dva identické fragmenty Fab vázající se na antigen, když se jedna molekula protilátky váže na dva identické monovalentní hapteny, každý fragment Fab se nezávisle váže na jednu haptenovou molekulu. Vazba monovalentního antigenu (Ag) na každé místo protilátky může být reprezentována následující rovnicí:
kde k1 je přímá konstanta (asociace); - inverzní konstanta (disociace); Ab - protilátka.
Poměr k1 / k-1 je asociativní konstanta K, míra afinity (afinity). Lze jej vypočítat z poměru koncentrace vázaných komplexů antigen-protilátka k koncentraci nenavázaných (volných) antigenů a protilátek..
Asociační konstanta (K) je skutečně měřítkem afinity (afinity) protilátky a antigenního epitopu. Pokud jsou všechny protilátky, které vážou odpovídající hapteny nebo antigenní epitopy, identické (jako v případě monoklonálních protilátek), pak konstanta K je interní asociační konstanta. Avšak vzhledem k tomu, že sérové protilátky, i ty, které interagují pouze s jediným epitopem, jsou heterogenní, je průměrná konstanta asociace všech protilátek k epitopům označena jako K0..
Interakce mezi protilátkami a každým epitopem multivalentního antigenu se řídí kinetikou a silami podobnými těm, které se účastní interakce mezi protilátkami a hapteny, protože každý antigenní epitop reaguje s odpovídající protilátkou stejným způsobem, jak je popsáno výše..
Asociační konstanta může být stanovena pomocí metody rovnovážné dialýzy. K tomu se používá dialyzační komora se dvěma kompartmenty, oddělená polopropustnou membránou, skrz kterou mohou volně pronikat molekuly vhodné velikosti. Protilátky jsou umístěny na jedné straně semipermeabilní membrány a nemohou proniknout skrz ni kvůli jejich velké velikosti. Na druhou (antigenní) stranu membrány se přidá známý počet malých rozpustných radioaktivně značených haptenů, oligosacharidů nebo oligopeptidů, což poskytuje epitopy komplexních uhlohydrátů nebo proteinů.
V okamžiku zahájení se hapten nebo antigenní epitop (dále označovaný jako ligand) začíná difundovat přes membránu; po dosažení rovnováhy bude koncentrace volných ligandů stejná na obou stranách membrány. Celkový počet ligandů však bude větší na straně, na které jsou umístěny protilátky, protože některé z ligandů se budou vázat na molekuly protilátek. Rozdíl v koncentraci ligandů ve dvou kompartmentech dialyzační komory odráží koncentraci ligandů navázaných na protilátky (tj. Komplexy antigen-protilátka). Čím vyšší je afinita protilátek, tím více se váže ligandy.
Kromě toho mohou být v této studii použity různé koncentrace ligandů, protože koncentrace protilátek umístěných v dialyzační komoře může být předem stanovena a zůstává konstantní. Tento přístup se používá v tzv. Scatchardově metodě. Používá se v situaci, kdy je nutné určit, zda jsou zkoumané protilátkové přípravky homogenní (například monoklonální protilátky) nebo heterogenní (například polyklonální antisérum), nebo měřit průměrnou afinitní konstantu (K0)..
Afinita a letectví
Jak bylo uvedeno výše, vnitřní asociační konstanta charakterizující asociaci protilátky s antigenním epitopem nebo haptenem je definována jako afinita, afinita. Pokud antigen sestává z mnoha opakujících se identických epitopů nebo je polyvalentní, závisí interakce mezi celou molekulou antigenu a protilátkou nejen na afinitě každého epitopu a odpovídající protilátky, ale také na celkové afinitě všech zúčastněných epitopů. Například vazebná afinita anti-A protilátky k multivalentnímu antigenu A může být o čtyři až pět řádů vyšší než afinita vazby stejné protilátky (tj. Anti-A) na monovalentní antigen A (viz obr. 5.1).
Důvod je ten, že párování anti-A protilátek s antigenem A je zvýšeno zvýšením počtu míst antigenu A, se kterými mohou anti-A protilátky reagovat.
Termín „afinita" označuje vnitřní asociační konstantu mezi protilátkou a monovalentním ligandem, jako je hapten, a termín „avidita" se používá k označení celkové vazebné síly mezi protilátkami a multivalentním antigenem. IgM protilátky tedy zpravidla mají větší aviditu než IgG protilátky, ačkoli spojení každého fragmentu Fab molekuly IgM s ligandem může mít stejnou afinitu jako fragment Fab molekuly IgG..
Sekundární interakce mezi protilátkami a antigeny
Aglutinační reakce
Aglutinace antigenů, když jsou zesítěny protilátkami, závisí na správném poměru mezi množstvím antigenu a protilátkami. Jednou technikou, která se někdy používá k měření hladiny sérových protilátek specifických pro částicové antigeny, je aglutinační test. Citlivější kvantitativní testy (např. Enzymový imunotest, diskutovaný níže) tuto technologii měření sérových protilátek do značné míry nahradily..
Aglutinační titrace konkrétního séra skutečně umožňuje pouze semikvantitativní stanovení protilátek přítomných v séru; není to způsob, jak kvantifikovat koncentraci protilátek (hmotnost-objem). Tato studie se provádí smícháním dvojnásobného sériového ředění séra s fixovaným antigenem. Vysoké ředění séra obvykle nezpůsobuje aglutinaci antigenu, protože v takových ředěních není obsah protilátek dostatečný pro rozvoj viditelné, vizualizované aglutinace..
Nejvyšší ředění séra, které dává aglutinaci a po kterém se aglutinace nevyvíjí, se nazývá titr. Často se stává, že k aglutinaci nedochází ani při vysokých koncentracích protilátek, i když při větším ředění séra dochází k této reakci. Zkumavky s vysokou koncentrací séra, které se neaglutinují, se nazývají prozone. Protilátky jsou v tomto prozonu hojné. Aglutinace se nemusí vyvíjet s vysokým poměrem protilátek k antigenu, protože každý epitop na částici je vázán na samostatnou molekulu antigenu, což zabraňuje zesítění mezi různými částicemi.
Vzhledem k jevu prozonu je při stanovení aglutinačních protilátek proti specifickému antigenu nezbytné testovat sérum v několika ředěních. Testování séra pouze v jednom ředění může vést k neopodstatněným závěrům při absenci aglutinace, protože to znamená prozon i žádné protilátky.
Zeta potenciál
Povrch některých korpuskulárních antigenů může mít elektrické náboje, jako je síť negativních nábojů na povrchu červených krvinek, vytvořených zbytky kyseliny sialové. Když jsou tyto nabité částice ponořeny do solného roztoku, vzniká mezi nimi elektrický potenciál, nazývaný potenciál zeta, který zabraňuje tomu, aby se částice dostaly příliš blízko. Tento potenciál zabraňuje aglutinaci nabitých částic protilátkami, zejména erytrocyty, protilátkami třídy IgG. Vzdálenost mezi fragmenty Fab v molekule IgG, a to i v maximální vzdálenosti, je příliš malá na účinnou vazbu dvou červených krvinek a překonání potenciálu zeta.
Třebaže IgG může být namířen proti antigenům na negativně nabitém povrchu erytrocytů, aglutinace se nemůže vyvinout kvůli odpuzování díky potenciálu zeta. Současně jsou některé fragmenty Fab v pentameru IgM dostatečně daleko od sebe a mohou vázat erytrocyty oddělené potenciálem zeta. Tato vlastnost protilátek třídy IgM, stejně jako pentavalence, je hlavním důvodem jejich účinnosti jako protilátek-aglutininů.
Po mnoho let byly učiněny pokusy zlepšit aglutinační reakci snížením potenciálu zeta různými metodami, ale žádná z nich se nestala univerzální nebo dostatečně účinnou. Nicméně v 50. letech 20. století. R. Coombs navrhl metodu, která tento problém odstranila. Metoda popsaná níže usnadňuje aglutinaci erytrocytů s protilátkami IgG specifickými pro povrchové antigeny erytrocytů. Může být také použit při detekci neaglutinačních protilátek, které jsou přítomny na povrchu erytrocytů..
Coombsův test
Coombsův test používá protilátky proti imunoglobulinům (proto se někdy nazývá antiimunoglobulinový test). Je založen na dvou důležitých faktech: 1) imunoglobuliny jednoho biologického druhu (například člověka) jsou imunogenní, když jsou zavedeny do těla jiného biologického druhu (například králíka) a vedou k produkci protilátek proti imunoglobulinům; 2) většina antiimunoglobulinů (například králičích protilátek proti lidskému Ig) se váže na antigenní determinantu na Fc fragmentu protilátek, přičemž fragmenty Fab ponechávají volnost pro reakci s antigenem.
Například pokud jsou lidské IgG navázány na odpovídající epitopy na povrchu erytrocytů, pak přidání králičích protilátek k lidskému IgG povede k jejich vazbě na Fc fragmenty lidských protilátek již připojených k erytrocytům pomocí fragmentů Fab (obr. 5.2). Tyto králičí protilátky se vážou nejen k lidským protilátkám, které jsou zase navázány na erytrocyty, ale také vytvářejí křížové vazby (mosty) mezi lidskými protilátkami umístěnými na relativně vzdálených erytrocytech, čímž překonávají oddělení kvůli potenciálu zeta, což vede k aglutinace. Přidání antiimunoglobulinů způsobuje aglutinaci, i když protilátky proti červeným krvinkám jsou přítomny v dostatečně vysokých koncentracích, aby vyvolaly prozonový jev.
Obr. 5.2. Coombsův test (antiimunoglobulin)
Existují dvě varianty Coombsovy reakce: přímé a nepřímé Coombsovy testy. Tyto dvě verze se v technice mírně liší, ale obě jsou založeny na stejném principu: použití heterologních antiimunoglobulinů k detekci interakce antigenu a protilátky. V přímém Coombsově testu se antiimunoglobuliny přidávají do částic (např. Červených krvinek), aby detekovaly protilátky navázané na antigeny na jejich povrchu. Tento test se například používá, když je novorozenec podezřelý, že má hemolytické onemocnění způsobené mateřskými IgG anti-R-protilátkami vázanými na dětské erytrocyty..
Aby se prokázala platnost takových podezření, měly by být při přímém Coombsově testu získány následující výsledky: přidání antiimunoglobulinů k suspenzi erytrocytů dítěte vazbou antiimunoglobulinů k mateřským protilátkám na povrchu erytrocytů by mělo způsobit aglutinaci. Nepřímý Coombsův test se používá k detekci protilátek v séru, které jsou specifické pro antigeny na částicích. Přidání sérových protilátek k částicím nemusí vést k aglutinaci v důsledku přítomnosti potenciálu zeta. Následné přidání antiimunoglobulinů jistě způsobí aglutinaci.
Nejčastěji se nepřímý Coombsův test používá k detekci IgG protilátek proti Rh faktoru v krvi Rh-negativních žen. Tento postup zahrnuje jednak reakci ženského séra s Rh-pozitivními erytrocyty, a za druhé, přidání činidla s antiimunoglobulinem (jako v přímý Coombsův test). Přímý Coombsův test tedy detekuje vázané protilátky, zatímco nepřímý test detekuje sérum.
Zpočátku byl název „Coombsův test“ použit pro reakci k detekci lidských protilátek na povrchu červených krvinek. Dnes se tento termín používá k označení jakékoli reakce pro detekci imunoglobulinů spojených s antigeny pomocí antiimunoglobulinu.
Pasivní aglutinace
Aglutinační reakce může být prováděna s korpuskulárními antigeny (například s červenými krvinkami nebo bakteriemi) a rozpustnými alergeny, pokud lze rozpustný antigen bezpečně připojit k nerozpustným částicím.
Například rozpustný antigen thyroglobulin může být fixován na latexových částicích, a pak přidání protilátek k thyroglobulinu povede k aglutinaci latexových částic potažených thyroglobulinem. Samozřejmě přidání rozpustného antigenu k protilátkám před jejich interakcí s latexovými částicemi potaženými thyroglobulinem inhibuje aglutinaci, protože protilátky se nejprve vážou k rozpustnému antigenu. Pokud je rozpustný antigen přítomen v nadbytku, protilátky se obecně nebudou moci vázat na antigen vázaný na povrch částic.
Poslední příklad se nazývá inhibice aglutinace. Je třeba rozlišovat mezi takovým potlačením a případy, kdy protilátky proti určitým virům zabraňují aglutinaci erytrocytů samotnými virovými částicemi. V takové situaci jsou protilátky směrovány do části nebo částí virové obálky, které se vážou na odpovídající receptory na červených krvinkách.
Pokud je antigen přirozenou součástí částice, nazývá se reakce přímou aglutinací. Pokud dojde k reakci mezi protilátkami a rozpustným antigenem, který byl dříve fixován na nerozpustné částice, nazývá se reakce pasivní aglutinací.
Aglutinační reakce (přímá nebo nepřímá, s Coombsovým testem nebo bez něj) se v klinické praxi široce používá. Kromě již uvedených příkladů zmiňujeme typizaci erytrocytů v krevních bankách, diagnostiku různých imunitně zprostředkovaných hemolytických onemocnění (jako je autohemolytická anémie vyvolaná léky), test revmatoidních faktorů (lidský IgM na lidský anti-IgG), diagnostické testy na syfilis a latex test odhalit těhotenství. Cílem posledně uvedeného je detekovat lidský chorionický gonadotropin v moči těhotné ženy.
Srážkové reakce
Reakce v roztocích
Na rozdíl od aglutinačních reakcí, které se vyskytují mezi protilátkami a korpuskulárními antigeny, se precipitační reakce vyvíjejí, když jsou smíchány protilátky a rozpustné antigeny. Stejně jako v případě aglutinace dochází ke srážení komplexů antigen-protilátka v důsledku skutečnosti, že molekuly bivalentních protilátek jsou schopny vázat se na molekuly multivalentních antigenů a vytvářet mříž.
Po dosažení určité velikosti přestane být polymolekulární komplex antigen-protilátka rozpustný a vysráží se z roztoku.
Na obr. 5.3 ukazuje kvantitativní charakteristiky srážkové reakce. Když je roztok se zvyšující se koncentrací antigenu přidán do několika zkumavek obsahujících roztok protilátek o konstantní koncentraci, množství sraženiny se změní. Hmotnost sraženiny v každé zkumavce může být měřena různými metodami..
Když se graficky zobrazuje hmotnost sraženiny vzhledem k množství přidaného antigenu, získáme křivku srážení podobnou křivce znázorněné na Obr. 5.3.
Obr. 5.3. Srážková reakce
Tři zóny pod křivkou znázorněnou na obr. 5,3: 1) nadbytek protilátek; 2) ekvivalence; 3) nadbytek antigenů. V zóně ekvivalence je poměr antigenů a protilátek optimální pro maximální srážení; v oblastech nadbytku protilátek nebo antigenů nevede poměr činidel k účinnému zesítění a nevytváří se žádná sraženina.
Je třeba zdůraznit, že zóny na křivce srážení byly vybrány na základě množství vysrážených komplexů antigen-protilátka. Zóny nadměrných antigenů nebo protilátek však mohou obsahovat rozpustné komplexy antigen-protilátka; zejména v oblasti nadměrných antigenů, když se vytvoří malé množství sraženiny, je v supernatantu přítomna většina komplexů antigen-protilátka. Množství vytvořené sraženiny tedy závisí na poměru mezi reaktivními antigeny a protilátkami. Správný poměr činidel vede k vytvoření maximálního množství sraženiny; nadbytek antigenů (nebo protilátek) vede k tvorbě rozpustných komplexů.
Srážkové reakce v gelech
Srážkové reakce mezi rozpustnými antigeny a protilátkami se mohou vyvíjet nejen v roztocích, ale také na polotuhých médiích, jako je například agarový gel. Když se rozpustné antigeny a protilátky vmíchají do jamek v gelu (obr. 5.4, A). činidla do něj začnou difundovat a v bezprostřední blízkosti buňky je koncentrace látky největší a se vzdáleností klesá. V určité vzdálenosti od obou buněk se reagující antigeny a protilátky setkají v koncentracích, které jsou optimální pro tvorbu sraženiny.
Obr. 5.4. (A) Gelová difúze: protilátky a jeden antigen. (B) Difúze v gelu: protilátky a antigeny 1, 2, 3
Pokud kompartment protilátky obsahuje směs protilátek 1, 2 a 3, specifických pro antigeny 1, 2 a 3, a difúzní kapacita antigenů je odlišná (difúzní koeficient 1> 2> 3), pak se vytvoří srážkové linie ve třech různých polohách. Vznikají díky skutečnosti, že protilátky anti-1, anti-2 a anti-3 reagují s antigeny 1, 2 a 3 ve třech různých zónách ekvivalence (obr. 5.4, B). Rozdíly v míře difúze antigenů a protilátek jsou spojeny s rozdíly v koncentraci, molekulové velikosti nebo tvaru..
Metoda dvojité difúze vyvinutá O. Ouchterlony (O. Ouchterlony) (tento název se někdy používá k popisu metody místo výrazu „dvojitá difúze“), ve kterém se protilátka a antigen difundují k sobě, je velmi užitečná při určování antigenních interakcí mezi různými látkami. Během difúze do gelu existují tři varianty reakce (obr.5.5): identita, rozdíl v antigenech a částečná identita. V případě, že se antigenní vlastnosti molekul shodují, reakce se vytvoří podle modelu identity.
Obr. 5.5. Varianty dvojité difúze v gelu: identita (A), rozdíly (B) a částečná identita (C) antigenů
Průnik precipitačních linií mezi sebou odpovídá modelu, ve kterém se antigeny navzájem liší. Konečně v případě, kdy antigeny nejsou úplně identické, tj. obsahují epitopy odpovídající a neodpovídající protilátkám, v gelu se tvoří srážková čára podobná čelním ostrám.
Radiální imunodifúze
Radiální imunodifúzní test je variantou testu dvojité difúze (obrázek 5.6). Jamky obsahují antigen v různých koncentracích a protilátky jsou rovnoměrně distribuovány na agarovém gelu, takže precipitační linie vypadá jako precipitační kroužek kolem jamky. Vzdálenost, kterou se srážkový kruh pohybuje od středu buňky, je přímo úměrná koncentraci antigenu v ní. Graficky lze znázornit vztah mezi koncentrací antigenu v jamce a průměrem precipitačního kruhu (viz obr. 5.6)..
Pokud buňky, například F a G, obsahují neznámé množství jakéhokoli antigenu, může být jeho koncentrace stanovena porovnáním průměrů precipitačních kruhů s průměrem kruhu vytvořeného buňkou se známou koncentrací antigenu..
Obr. 5.6. Radiální difúze. Buňky A, B, C, D a E obsahují známé koncentrace antigenu; F a G jsou neznámé koncentrace, které lze vypočítat pomocí grafu
Metoda radiální imunodifúze se používá na klinice ke stanovení koncentrace proteinů v séru. Za tímto účelem se do gelu injektují protilátky proti různým proteinům krevního séra: koncentrace specifického proteinu se stanoví porovnáním průměru vytvořeného srážovacího kruhu s průměrem kruhu získaného za použití studovaného proteinu při známé koncentraci.
Imunoelektroforéza
Imunoelektroforéza je separace směsi proteinů pomocí elektrického pole (elektroforéza), po níž následuje stanovení těchto proteinů pomocí protilátek, které difundují v gelu. Tuto metodu je velmi vhodné použít při analýze směsi antigenů pomocí roztoku obsahujícího protilátky proti antigenům sledované směsi. Například při klinické charakterizaci proteinů lidského séra je malá kapka séra pacienta umístěna do jamky ve středu proužku potaženého agarovým gelem. Poté se sérum podrobí elektroforéze, která odděluje různé složky podle jejich pohyblivosti v elektrickém poli..
Po elektroforéze je podél okraje proužku vyříznuta drážka, do které jsou umístěny protilátky proti proteinům lidského séra. Tyto protilátky difundují v agaru stejně jako oddělené sérové proteiny. S optimálním poměrem antigenu a protilátek pro každý antigen a odpovídající protilátky se vytvoří srážková linie. V důsledku toho se objeví obrázek, jehož vzorek je znázorněn na Obr. 5.7.
Při porovnání distribuce a intenzity linií tvořených sérem zdravé osoby a linií získaných při studiu vzorků séra od pacientů je možné odhalit nepřítomnost, nadbytek nebo jiné změny v jednom nebo více sérových proteinech. Skutečně to bylo poprvé pomocí metody imunoelektroforézy v roce 1952, kdy byl identifikován syndrom deficience protilátek (Brutonova agammaglobulinémie)..
Obr. 5.7. Imunoelektroforéza sérového proteinu
Western blot (imunoblotting)
Při metodě Western blot (imunoblotting) je v první fázi antigen (nebo směs antigenů) separován v gelu elektroforézou. Oddělený materiál se potom přenese (blotuje) na listy schopné vázat protein (např. Z nitrocelulózy). Dále se protilátky aplikují na nitrocelulózový list, který se váže na specifické antigeny. Protilátky jsou značeny například radioaktivními izotopy. Pokud potřebujete identifikovat lokalizaci komplexu protilátka-antigen, ke kterému je připojena první protilátka, použijte značené protilátky proti imunoglobulinům.
Tato technika, nazvaná Western blotting, je široce používána ve výzkumných a klinických laboratořích k identifikaci a charakterizaci antigenů. K potvrzení diagnózy infekce HIV se používá zejména Western blotting. Séra pacientů jsou umístěna na nitrocelulózovou fólii, na které jsou navázány antigeny HIV. Detekce specifických protilátek je silným důkazem virové infekce (obrázek 5.8)..
Obr. 5.8. Výsledky imunoblottingu séra dvou infikovaných HIV a jednoho zdravého člověka